科研文獻(xiàn):牛胚胎低溫儲(chǔ)存延長(zhǎng)辦法研究,添加魚(yú)抗凍蛋白可有效延長(zhǎng)牛胚胎的低溫儲(chǔ)存
自20世紀(jì)70年代牛胚胎冷凍保存技術(shù)開(kāi)始發(fā)展以來(lái)，胚胎的冷凍保存已成為胚胎移植的常規(guī)技術(shù)環(huán)節(jié)之一，20世紀(jì)90年代，冷凍胚胎的移植數(shù)量就已經(jīng)占胚胎移植總數(shù)的80%。然而，行業(yè)里冷凍胚胎的移植妊娠率一直都低于鮮胚移植妊娠率，且常用于冷凍胚胎的液氮在存儲(chǔ)過(guò)程中需不斷補(bǔ)充，運(yùn)輸不便。因此，有必要研究在無(wú)液氮的情況下短期非冷凍保存胚胎的可行性，為牛胚胎移植提供一種更為簡(jiǎn)單、實(shí)惠且不需要特殊設(shè)備，適用于牧場(chǎng)條件下的胚胎短期儲(chǔ)存方法。
日本的一項(xiàng)研究表明，魚(yú)源性抗凍蛋白(AFP) 具有保護(hù)細(xì)胞及其細(xì)胞膜免受低溫?fù)p傷的特殊能力，因此研發(fā)了一種具有該蛋白的培養(yǎng)基，可使牛胚胎在4℃下保存10天乃至更長(zhǎng)時(shí)間。
AFP最初是從在冰雪環(huán)境中生存的魚(yú)類(lèi)的血液中分離出來(lái)的一種大分子物質(zhì)，可以與冰晶結(jié)合，并防止凍結(jié)。根據(jù)氨基酸序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)，AFP可以分為抗凍蛋白AFP I-IV型和抗凍糖蛋白AFGP型。不同分型對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用略有區(qū)隔，如AFP I-III型可在4℃下保護(hù)牛卵母細(xì)胞膜24小時(shí)，AFP I型可使綿羊胚胎在4℃下保存長(zhǎng)達(dá)4天。我們選擇了一種名為nfeAFP11 的AFP III型亞型，它是具有66個(gè)殘基的單體多肽，初步表明其對(duì)胚胎保存具有卓越的保護(hù)能力。
科研人員首先進(jìn)行了重組nfeAFP11的制備，并以日本黑牛為供體進(jìn)行了體內(nèi)胚胎的生產(chǎn)回收。為了評(píng)估nfeAFP11的效果，科研人員將優(yōu)質(zhì)牛胚胎(桑椹胚至囊胚階段)轉(zhuǎn)移到在石蠟油覆蓋下的TCM199小滴內(nèi)，并分別制作了含20-50% FBS以及是否添加nfeAFP11的TCM199小滴，在將胚胎裝入麥管后對(duì)胚胎進(jìn)行了低溫保存。隨后，160個(gè)優(yōu)質(zhì)日本黑牛體內(nèi)胚被隨機(jī)分組，統(tǒng)計(jì)低溫儲(chǔ)存240小時(shí)后胚胎的存活率和孵化率。結(jié)果顯示，添加nfeAFP11的組胚胎存活率明顯高于不含nfeAFP11的組(表1)。與其他實(shí)驗(yàn)組相比，加入nfeAFP11 的20% FBS組胚胎孵化率顯著增加（P < 0.05）。
為了檢查添加了nfeAFP11的冷凍胚胎的妊娠率，科研人員還以荷斯坦奶牛為受體，將在4-5℃下儲(chǔ)存了240小時(shí)的4個(gè)體內(nèi)胚進(jìn)行了胚胎移植，該組冷凍胚胎的妊娠率為50%，且在妊娠30天和90天之間均沒(méi)有觀察到胚胎死亡。在妊娠285天左右，兩只受體各分娩了一只活的和一只死產(chǎn)的小牛。小牛的出生體重分別為38.0 kg（下圖，活產(chǎn)）和36.6 kg（死產(chǎn)），死產(chǎn)小牛未畸形。
冷凍胚胎產(chǎn)生的1日齡小牛
通過(guò)超數(shù)排卵來(lái)獲得胚胎是哺乳動(dòng)物人工繁育的必要手段，其中最主要的因素是胚胎的生存能力，延長(zhǎng)牛胚胎在低溫環(huán)境下的存活時(shí)間將為牛胚胎移植帶來(lái)更多便利，有利于群體遺傳改良工作的推進(jìn)。研究表明，使用含有AFP的培養(yǎng)基可將牛胚胎低溫儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)10天，為了更具實(shí)用價(jià)值，未來(lái)還可提供能夠在低溫下保存哺乳動(dòng)物胚胎超過(guò)10天的方案，我們相信其他類(lèi)型的AFP可能會(huì)更長(zhǎng)時(shí)間地保持哺乳動(dòng)物胚胎的活力。
參考文獻(xiàn)：Atsushi IDETA, Yoshito AOYAGI, Kanami TSUCHIYA, Yuuki NAKAMURA, Kou HAYAMA,Atsushi SHIRASAWA, Kenichiro SAKAGUCHI, Naomi TOMINAGA, Yoshiyuki NISHIMIYA and Sakae TSUDA. Prolonging hypothermic storage (4 C) of bovine embryos with fish antifreeze protein, Journal of Reproduction and Development, 2015 ,Vol. 61, No 1.
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力牧生物是國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)會(huì)員單位，澳洲和牛協(xié)會(huì)官方注冊(cè)會(huì)員；公司牛胚胎及凍精檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可委CNAS認(rèn)證；技術(shù)團(tuán)隊(duì)被授予“天津市高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)”，并承擔(dān)多項(xiàng)省部級(jí)科研項(xiàng)目，掌握可商業(yè)化的活體采卵(OPU)-體外受精(IVF)-胚胎移植(ET)技術(shù)體系，囊胚率、胚胎受孕率達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，已申報(bào)發(fā)明專(zhuān)利和實(shí)用新型專(zhuān)利約四十余項(xiàng)。
