前言
胚胎生產(chǎn)技術(shù)能通過減少世代間隔和提高選擇強(qiáng)度來促進(jìn)遺傳發(fā)育，現(xiàn)已成功在牛繁殖領(lǐng)域進(jìn)行商業(yè)應(yīng)用，理論上最有效的方法是利用最好的供體牛生產(chǎn)大量的體外胚，進(jìn)行活檢和冷凍并進(jìn)行遺傳評(píng)估，然后將最令人滿意的基因型轉(zhuǎn)移給受體。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，除了鮮胚移植還會(huì)涉及胚胎冷凍保存等環(huán)節(jié)，以便隨時(shí)隨地應(yīng)用。但在移植冷凍胚胎后平均妊娠率往往會(huì)稍低于鮮胚移植時(shí)的平均妊娠率，進(jìn)而導(dǎo)致一些優(yōu)質(zhì)胚胎的浪費(fèi)。本研究的目的旨在評(píng)估在慢速冷凍前后同一供體荷斯坦母牛體內(nèi)或體外生產(chǎn)的胚胎脂質(zhì)組成及變化，進(jìn)而為通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)成分提高胚胎對(duì)冷凍的耐受能力提供參考。
結(jié)果：
胚胎生產(chǎn)資料：通過OPU-IVF進(jìn)行5次體外胚胎生產(chǎn)，通過沖洗子宮角進(jìn)行3次體內(nèi)胚胎收集，以產(chǎn)生研究所需的胚胎。用IVF和沖胚采集程序分別產(chǎn)生了95枚和78枚（Q1級(jí))擴(kuò)張囊胚（見表1A、B）。IVF過程中每個(gè)供體在體外產(chǎn)生的Q1囊胚的平均數(shù)量為2.1±0.3，體內(nèi)胚胎期間每個(gè)供體為3.4±1.0。
牛胚胎的脂質(zhì)組成: 使用超高壓液相色譜 (UHPLC) 獲得了87個(gè)Q1擴(kuò)張囊胚的液相色譜高分辨率質(zhì)譜(LC-HRMS)光譜，并確定了1686個(gè)特征。檢查數(shù)據(jù)后，在質(zhì)量控制(QC)和同位素消除中消除變異系數(shù) (CV)優(yōu)于30%的離子，保留了496個(gè)特征。在這496個(gè)特征中，74個(gè)是使用SimLipid數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的，注釋的脂質(zhì)主要是甘油三酯 (32/74)，甘油二酯 (12/74)，甘油磷脂和溶血磷脂 (12/74)（補(bǔ)充表S1）。這87個(gè)Q1級(jí)囊胚中，43個(gè)由IVF獲得，44個(gè)由沖胚收集得。43個(gè)體外胚中提取了22個(gè)鮮胚的脂質(zhì)（13個(gè)雄性和9個(gè)雌性胚胎），21個(gè)胚胎（8個(gè)雄性和13個(gè)雌性胚胎）先冷凍后再進(jìn)行脂質(zhì)提取。對(duì)于44個(gè)體外胚，提取了22個(gè)鮮胚的脂質(zhì)（11個(gè)雄性和11個(gè)雌性胚胎），剩下22個(gè)胚胎（10個(gè)雄性和12個(gè)雌性胚胎）冷凍后進(jìn)行脂質(zhì)提?。▓D1）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：八頭荷斯坦青年母牛通過OPU-IVF和體內(nèi)胚胎收集程序生產(chǎn)體外和體內(nèi)胚胎。受精7天后，對(duì)所有1級(jí)擴(kuò)張囊胚進(jìn)行活檢和性別鑒定。每組一半在新鮮狀態(tài)下進(jìn)行脂質(zhì)提取，另一半在進(jìn)行脂質(zhì)提取之前先冷凍。脂質(zhì)提取物通過液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析并允許檢測(cè)496個(gè)特征。
體內(nèi)或體外產(chǎn)生的鮮胚中的脂質(zhì)質(zhì)譜特征：為評(píng)估胚胎來源對(duì)其脂質(zhì)譜的影響，使用了44個(gè)囊胚，包括22個(gè)體外胚和22個(gè)體內(nèi)胚（圖1）。主成分分析(PCA)顯示體內(nèi)（橙色點(diǎn)）和體外（藍(lán)色點(diǎn)）胚胎之間存在分離（圖2A）。正交偏最小二乘分析(O-PLS-DA)顯示了體內(nèi)（橙色點(diǎn)）和體外（藍(lán)色點(diǎn)）產(chǎn)生的胚胎之間的兩種不同特征的明顯區(qū)分，交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)能力(Q2)為0.88，并且該模型由CV-Anova評(píng)估具有良好的可靠性，p值<0.0001（圖2B）。擬合模型包括314個(gè)特征，這意味著大多數(shù)已識(shí)別特征（314/496）參與解釋體內(nèi)和體外產(chǎn)生的胚胎之間的脂質(zhì)特征差異（補(bǔ)充表S2）。單變量分析突出了體內(nèi)和體外對(duì)應(yīng)物之間的105個(gè)顯著不同的特征（p<0.05和倍數(shù)變化<0.66或>1.5），包括50種注釋脂質(zhì)（補(bǔ)充表S1）。在105個(gè)顯著特征中，27個(gè)的倍數(shù)變化大于2，表明體外產(chǎn)生的胚胎豐度增加，12個(gè)特征的倍數(shù)變化小于0.5，表明體外產(chǎn)生的胚胎豐度降低（表2）。在這105個(gè)顯著特征中，有10個(gè)在擬合模型中沒有發(fā)現(xiàn)，包括5種注釋脂質(zhì)、2種脂肪酰胺、胡椒素和N-油酰GABA、1種氧化甘油磷脂、OHOHA-PC和2種三酰甘油、TG(16:0/16:1/16:1)和TG(46:0)。基于倍數(shù)變化和p值的火山圖突出了體外產(chǎn)生的胚胎的一般脂質(zhì)富集，特別是在甘油三酯(TG)和氧化甘油磷脂(OHHdia-PS)中表現(xiàn)出大于40的倍數(shù)變化（圖2C）。相反，體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎富含甘油磷脂，特別是磷脂酰乙醇胺(PE)、絲氨酸 (PS)、甘油(PG)和肌醇(PI)。
圖2如下，(A)主成分分析圖(PCA)，代表根據(jù)主成分分析的體內(nèi)和體外胚胎之間的差異。橙色點(diǎn)顯示體內(nèi)來源胚胎的數(shù)據(jù)，藍(lán)色點(diǎn)顯示體外來源胚胎的數(shù)據(jù)。(B)通過正交偏最小二乘判別分析(O-PLS-DA)進(jìn)行多變量分析，根據(jù)胚胎的脂質(zhì)分布區(qū)分胚胎起源（體內(nèi)與體外）。(C)基于倍數(shù)變化和p值的火山圖單變量分析，突出顯示幾種脂質(zhì)。藍(lán)色和橙色點(diǎn)對(duì)應(yīng)體外和體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎之間顯著不同的脂質(zhì)?；疑c(diǎn)代表不重要的點(diǎn)。粉紅色圓點(diǎn)對(duì)應(yīng)于具有顯著p值但倍數(shù)變化在0.66和1.5之間的脂質(zhì)。該區(qū)域右側(cè)的所有脂質(zhì)在體外胚胎都過多（藍(lán)點(diǎn)），而該區(qū)域左側(cè)的脂類在體內(nèi)胚中過多（橙色點(diǎn)）。在p<0.05和倍數(shù)變化大于1.5或小于0.66時(shí)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。顯著不同的注釋脂質(zhì)在火山圖中由以下縮寫表示，磷脂酰乙醇胺 (PE)、肌醇 (PI)、絲氨酸 (PS)、甘油 (PG)、甘油三酯 (TG) 和氧化甘油磷脂 (OHHdia-PS 和 PKHdiA -PS）。
表2. 體外和體內(nèi)胚之間差異表達(dá)的脂質(zhì)
在該表中，在FC>1.5或<0.66的105種不同脂質(zhì)中，僅顯示了39種最不同的脂質(zhì)，此處顯示了具有FDR（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）的p值。補(bǔ)充表S1中提供了包含所有重要特征和脂質(zhì)注釋的完整表格。
在慢速冷凍前后體內(nèi)胚的脂質(zhì)質(zhì)譜特征：為了分析慢速冷凍過程對(duì)體內(nèi)胚脂質(zhì)譜的影響，使用了44個(gè)囊胚，分為兩組，一半的體內(nèi)胚進(jìn)行慢速冷凍。PCA顯示出區(qū)分體內(nèi)新鮮（紅）和冷凍（綠）胚胎的趨勢(shì)（圖 3A）。多變量分析 (O-PLS-DA) 顯示新鮮和冷凍體內(nèi)胚之間的兩種不同特征的明顯區(qū)分，交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)能力(Q2)為0.82，該模型由CV-Anova評(píng)估具有良好的可靠性，p值<0.0001（圖3B）。擬合模型包括162個(gè)參與解釋新鮮體內(nèi)胚和冷凍胚之間脂質(zhì)分布差異的特征（補(bǔ)充表 S2）。單變量分析突出了新鮮和冷凍體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎之間顯著不同的35個(gè)特征（p<0.05，F(xiàn)C<0.66或>1.5）（表3），包括20種注釋脂質(zhì)（補(bǔ)充表S1）。在35個(gè)顯著特征中，19個(gè)表現(xiàn)出> 1.5的倍數(shù)變化，表明與新鮮胚胎相比，冷凍體內(nèi)胚的豐度增加，和16個(gè)特征表現(xiàn)出的倍數(shù)變化< 0.66，表明與新鮮胚胎相比，冷凍體內(nèi)胚的豐度降低（表3）。35個(gè)顯著特征中，有兩種未被發(fā)現(xiàn)，包括一種類二十烷酸、乙基-二乙酰氧基-6E、8E、10E、14Z-二十碳四烯酸酯和一種單酸甘油酯MG(22:5)。
火山圖體現(xiàn)了新鮮體內(nèi)胚中溶血磷脂酰膽堿 (LPC) 過多，及冷凍胚中兩種甘油單酯 (MG) 和一種磷脂酰甘油 (PG) 過多（圖3C）。單變量分析還顯示LPC組成存在差異，尤其是LPC (18:2)，它僅存在于新鮮胚胎中，因此倍數(shù)變化等于0.00（表3）。
慢速冷凍前后體外胚的脂質(zhì)譜特征：為分析慢速冷凍過程對(duì)體外胚脂質(zhì)質(zhì)譜的影響，使用了43個(gè)囊胚，其中冷凍了21個(gè)胚胎。PCA顯示體外鮮胚和冷凍胚之間存在重疊（圖4A）。多變量分析(O-PLS-DA)顯示兩個(gè)不同的特征，交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)能力(Q2)為0.82，并且該模型由CV-Anova評(píng)估具有良好的可靠性，p值< 0.0001（圖4B）。模型包括47個(gè)特征，這些特征參與解釋了體外鮮胚和冷凍胚之間的脂質(zhì)特征差異（補(bǔ)充表S2）。單變量分析突出了新鮮和冷凍體外胚之間顯著不同的四種脂質(zhì)（表4），其中三種注釋為L(zhǎng)PC（補(bǔ)充表S1）。4個(gè)顯著特征都具有<0.66 的倍數(shù)變化，表明與新鮮胚胎相比，冷凍體外產(chǎn)生的胚胎豐度降低（表4）?；鹕綀D表明了新鮮體外胚中LPC過多（圖4C）。
討論：
本文結(jié)果表明胚胎脂質(zhì)譜主要受體外培養(yǎng)方案和慢速冷凍過程的影響，胚胎來源對(duì)脂質(zhì)譜有非常大的影響，這意味著與母體生理環(huán)境相比，體外培養(yǎng)條件強(qiáng)烈改變了脂質(zhì)代謝。實(shí)際上與體內(nèi)胚相比，體外胚富含脂質(zhì)，尤其是甘油三酯和氧化甘油磷脂。培養(yǎng)基的組成可以改變卵母細(xì)胞和胚胎中脂質(zhì)的含量，尤其是加入血清時(shí)。Fergusson和Leese證明，在四細(xì)胞階段牛胚胎的培養(yǎng)基中添加10%的血清會(huì)導(dǎo)致甘油三酯水平顯著增加。在培養(yǎng)基中添加5%的胎牛血清也可以增加脂質(zhì)含量，如棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸和硬脂酸。
大量的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)會(huì)影響凍存過程后胚胎的復(fù)蘇和存活。減少這些脂質(zhì)需要相當(dāng)大的努力。在培養(yǎng)基中添加含有脂質(zhì)的血清會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟率和囊胚率降低，及凋亡細(xì)胞數(shù)量的增加。在沒有血清的情況下，會(huì)使受精卵從1細(xì)胞到4細(xì)胞的發(fā)育周期延長(zhǎng)4-5小時(shí)，培養(yǎng)過程血清減少會(huì)使4細(xì)胞期胚胎的持續(xù)時(shí)間減少?gòu)亩l(fā)囊胚過早形成。因此，在使用合成血清替代品中可以找到一種解決方案。吩嗪乙基硫酸鹽與添加FCS產(chǎn)生的結(jié)果相似，同時(shí)減少了添加到培養(yǎng)基中的脂滴積累，提高了冷凍保存后的擴(kuò)張和孵化率。
另一種解決方法是在胚胎培養(yǎng)的最后24小時(shí)內(nèi)去除血清。去除血清刺激脂肪分解，導(dǎo)致游離脂肪酸增加，通過β-氧化消耗能量。添加脂解劑也可以降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的水平。在脂解劑中，腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、毛喉素等通過直接作用于脂解途徑的成分來刺激細(xì)胞內(nèi)脂解。與未補(bǔ)充脂解劑的胚胎相比，在玻璃化冷凍前48小時(shí)在胚胎的培養(yǎng)基中添加10μM毛喉素誘導(dǎo)脂肪分解，顯著提高了妊娠率（18.5%對(duì)48.8%）。
脂質(zhì)過多與凍存效果降低之間的因果關(guān)系尚未完全確定。胚胎富含脂質(zhì)會(huì)導(dǎo)致凍存的效果較低，但磷脂似乎對(duì)冷凍保存過程很重要。通過提高體外胚的磷脂含量，胚胎質(zhì)量可能會(huì)提高。Banliat 等人已經(jīng)證明在培養(yǎng)基中以0.05毫克蛋白質(zhì)/毫升的濃度添加外泌體，培養(yǎng)7天后可使囊胚中的磷脂增加。
體內(nèi)和體外胚中，鮮胚富含溶血磷脂酰膽堿，而在胚胎凍融后僅有少量的這種脂質(zhì)。數(shù)據(jù)表明使用文中慢速冷凍方案，LPCs對(duì)冷凍保存高度敏感。LPC的這種高敏感性在人血漿、血清和尿液中沒有報(bào)道，在幾次冷凍(-20℃)/升溫循環(huán)后它們似乎保持穩(wěn)定。LPC不僅對(duì)慢速冷凍敏感，對(duì)玻璃化冷凍也很敏感。事實(shí)上，小鼠卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍后，溶血磷脂含量也降低了。LPC含量的這種降低有助于解釋移植后冷凍體外產(chǎn)生的胚胎的存活率、總細(xì)胞數(shù)和妊娠率的降低。單變量分析并未強(qiáng)調(diào)新鮮體內(nèi)與體外胚中比較這種大量的LPC。盡管如此，體外產(chǎn)生的胚胎的LPC是體內(nèi)胚胎的1.6倍。這可能是體外培養(yǎng)基造成的，因?yàn)檠逯泻?LPA。LPA是小分子，通過Lats1/2激酶（大型腫瘤抑制因子1/2）的失活和YAP/TAZ磷酸化的減少來調(diào)節(jié)Hippo通路，這會(huì)誘導(dǎo)它們的核易位，且會(huì)通過增加CDX2的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞分化。如果觀察到的LPC減少與胚胎質(zhì)量和存活率下降有關(guān)，未來的研究可能會(huì)集中在Hippo通路調(diào)節(jié)上以改善它。
該研究的獨(dú)創(chuàng)性在于能夠優(yōu)先考慮影響胚胎脂質(zhì)譜的因素。這樣，未來的研究應(yīng)該集中在培養(yǎng)條件和冷凍方案上，以便它們對(duì)胚胎的脂質(zhì)譜的影響較小。新穎之處還在于對(duì)胚胎進(jìn)行了單獨(dú)分析，從而能夠獲得更精確的胚胎脂質(zhì)譜并突出個(gè)體間的變異性。例如，防止溶血磷脂降解的冷凍介質(zhì)可能有助于改進(jìn)冷凍方案。但還需要進(jìn)一步的研究來研究脂質(zhì)與胚胎質(zhì)量和冷凍保存敏感性之間的關(guān)系。
參考文獻(xiàn)：
Sarah Janati ldrissi,Daniel Le Bourhis,Antoine Lefevre,Patrick Emond,Laurene Le Berre,Olivier Desnoes,Thierry Joly,Samuel Buff,Virginie Maillard,Laurent Schibler,Pascal Salvetti& Sebastien Elis
“Lipid profle of bovine grade-1 blastocysts produced either in vivo or in vitro before and after slow freezing process” scientific reports，(2021)11:11618
天津力牧生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱“力牧生物”, www.champion-discus.com ）成立于2016年，是一家專注于畜牧育種、遺傳改良、良種快繁的國(guó)家級(jí)高新技術(shù)企業(yè)。公司以分子育種、胚胎工程等動(dòng)物高效育種、快速繁育技術(shù)為核心，聯(lián)合國(guó)內(nèi)外知名研究機(jī)構(gòu)產(chǎn)學(xué)研合作，發(fā)展現(xiàn)代畜牧種業(yè)。目前公司已在國(guó)內(nèi)建立了遺傳性能優(yōu)異的純血和牛、韓牛、西門塔爾牛、荷斯坦牛的核心群體，利用現(xiàn)代生物育種技術(shù)體系加快優(yōu)良品種培育和快速繁育，以期為推動(dòng)我國(guó)畜牧產(chǎn)業(yè)種質(zhì)提升貢獻(xiàn)力量。
公司生物育種實(shí)驗(yàn)室達(dá)到《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》及《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求，是國(guó)內(nèi)率先獲得中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可證書的生物育種實(shí)驗(yàn)室；公司已通過ISO9001質(zhì)量管理體系認(rèn)證，牛胚胎工程全流程實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。
