此前在美國(guó)和加拿大胚胎移植協(xié)會(huì)的聯(lián)席會(huì)議上，有一個(gè)關(guān)于牛胚胎分級(jí)的會(huì)前研討會(huì)，與會(huì)者就如何對(duì)不同階段和質(zhì)量的胚胎進(jìn)行分級(jí)進(jìn)行了探討，其中體外生產(chǎn)（IVP）和體內(nèi)生產(chǎn)（IVD）胚胎之間的差異引發(fā)了大家更多關(guān)注。在這里，我們將回顧IVP和IVD胚胎分級(jí)所涉及的一些挑戰(zhàn)，并提出一種方法，以便于讓研究人員和從業(yè)者在此基礎(chǔ)上合作收集并輕松共享數(shù)據(jù)，為IVP胚胎分級(jí)提供最佳指南。
真正驗(yàn)證胚胎質(zhì)量的辦法是將其轉(zhuǎn)移給受體，看看是否有健康的后代產(chǎn)生。但移植每個(gè)胚胎是不切實(shí)際的，這就給從業(yè)者留下了一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，即僅憑觀察就能確定胚胎是否能受孕。雖然大多數(shù)從業(yè)者依托國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)（IETS手冊(cè)，第4版）制定的標(biāo)準(zhǔn)便可以更好地給體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎分級(jí)，并已經(jīng)注意到IVP胚胎與IVD胚胎存在差異，如從線粒體功能和代謝到發(fā)育速率和基因表達(dá)的差異等。這里不再贅述。此次我們將專注于IVD和IVP胚胎之間的可觀察到的差異。因?yàn)榇蠖鄶?shù)從業(yè)者和胚胎學(xué)家在看到一個(gè)好的胚胎時(shí)都知道是一個(gè)好的胚胎，但是當(dāng)涉及到中等質(zhì)量的胚胎（2級(jí)和3級(jí)）時(shí)，它們就很難區(qū)分了。許多人認(rèn)為IVP胚胎具有更多可變的形態(tài)，因此更難分級(jí)。其實(shí)，可以根據(jù)胚胎是否符合一些物理特征進(jìn)行分級(jí)，包括形狀，細(xì)胞質(zhì)的顏色/密度，細(xì)胞的數(shù)量和致密性，卵周隙面積，擠壓或退化細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞質(zhì)囊泡的頻率和大小以及相對(duì)于年齡的發(fā)育階段等。以下是一些最顯著的差異。
·卵周隙和壓實(shí)性
幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明了IVP和IVD胚胎在卵周隙大小方面的差異，這通常與胚胎在桑葚胚形成過程中的壓實(shí)程度有關(guān)。在Van Soom和de Kruif(1992)的一項(xiàng)研究中，將IVD的受精卵和2細(xì)胞胚胎與屠宰場(chǎng)產(chǎn)生的IVP的受精卵在相同的系統(tǒng)中培養(yǎng)，可以觀察到體外受精胚胎桑葚胚期的卵周隙縮小了。此外，IVP受精卵時(shí)期的卵周隙在體外胚胎整個(gè)發(fā)育過程中是最大的。盡管自記錄以來已進(jìn)行了24年的研究，這一特征目前在IVP胚胎中仍然可見(圖1)。
圖1 處于桑葚發(fā)育階段的IVP（A和C）和IVD（B和D）牛胚胎。注意IVP胚胎的卵黃周圍間隙較小，壓實(shí)性差。胚胎C的左上邊緣也有一些擠壓的物質(zhì)。IVD胚胎的卵周隙較均勻，桑葚胚的壓實(shí)度也比較均勻。
碎片細(xì)胞和擠壓細(xì)胞
許多從業(yè)者和胚胎學(xué)家已經(jīng)注意到與IVP胚胎相關(guān)的細(xì)胞碎片的數(shù)量和頻率有增加。這已在IVP和IVD胚胎的超微結(jié)構(gòu)分析中得到證實(shí)。Rizos及其同事（2002）在胚胎的卵周隙中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞碎片，并在囊胚腔的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)周圍發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞碎片。這可能使IVP胚胎分級(jí)特別困難，特別是在囊胚階段，當(dāng)碎片被壓縮在透明帶和擴(kuò)張的胚胎之間，導(dǎo)致其數(shù)量可能難以評(píng)估。
國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)胚胎分級(jí)指南規(guī)定，透明帶內(nèi)可活胚胎的細(xì)胞質(zhì)量超過85%為1級(jí)胚胎(最高質(zhì)量)， 2級(jí)50%，3級(jí)25%，4級(jí)<25%。能夠有效地評(píng)估胚胎中活細(xì)胞的數(shù)量對(duì)于為胚胎分級(jí)是至關(guān)重要的。圖2和圖3提供了IVP和IVD胚胎在不同發(fā)育階段具有不同數(shù)量碎片的例子。
圖2 兩個(gè)IVP胚胎(A和B)和一個(gè)IVD胚胎(C)具有不同數(shù)量的擠壓細(xì)胞或碎片。A是一種桑葚胚，其細(xì)胞碎片數(shù)量最少，因此按照該標(biāo)準(zhǔn)可以被歸類為1級(jí)胚胎，但壓實(shí)性差和卵周隙極小將使該胚胎降至2級(jí)。B組是早期IVP囊胚，有大量碎片，可以將其歸入2級(jí)類別。圖C是第7天IVD胚胎，具有可接受的碎片量，因此它仍被視為1-或高級(jí)2+。
圖3 如果在相當(dāng)?shù)偷墓β氏聮呙柽@組胚胎，人們可能很快就會(huì)認(rèn)為A圖中黃色箭頭所示的胚胎是1級(jí)胚胎。在高倍鏡下，人們可以更容易地看到擠壓在透明帶上的擠壓細(xì)胞，這可能被誤認(rèn)為是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊。這是一個(gè)很容易犯的錯(cuò)誤，如果分級(jí)時(shí)沒有在適當(dāng)?shù)姆糯蟊堵氏掠^察胚胎(至少60倍)。無組織或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形成不良是IVP胚胎的另一個(gè)常見特征。圖C為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)明確的IVP胚胎。
·液泡
一些胚胎的細(xì)胞中似乎有氣泡或液泡，這可能使它們呈現(xiàn)顆粒狀外觀。這發(fā)生在IVP和IVD胚胎中，盡管IVP胚胎的發(fā)生率似乎更高。IVP的胚胎在卵裂球的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表現(xiàn)出比IVD的胚胎更多的空泡化，液泡化的大小和豐度差異很大（圖4）。液泡化的原因尚不清楚，但通常與胚胎質(zhì)量差有關(guān)。
圖4 兩個(gè)廣泛液泡化的IVP胚胎。左圖有一個(gè)6細(xì)胞胚胎有各種大小的液泡。右面有一個(gè)囊胚，在滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞中可以看到許多非常小的液泡。
·細(xì)胞形狀、不透明度和脂質(zhì)
IVP和IVD胚胎的超微結(jié)構(gòu)分析也揭示了與脂質(zhì)含量有關(guān)的差異。并對(duì)來自超排卵奶牛的桑葚胚與來自屠宰場(chǎng)卵巢的桑葚胚進(jìn)行了比較。IVP胚胎的脂質(zhì)體積密度高于IVD胚胎。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，10%血清培養(yǎng)的IVP胚胎在前72 h的脂質(zhì)體積密度高于限制血清培養(yǎng)系統(tǒng)、無血清培養(yǎng)系統(tǒng)或體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎。其他研究小組也注意到IVP胚胎中脂滴的發(fā)生率高于IVD胚胎，證實(shí)了其他研究中注意到的情況，并與胚胎低溫耐受性差有關(guān)。較高的脂質(zhì)含量可以使胚胎看起來更黑，細(xì)胞更不透明。和液泡一樣，胚胎也會(huì)呈顆粒狀。Van Soom和de Kruif(1992)指出，與IVD胚胎不同，IVP胚胎有更多方形、腫脹的卵裂球和囊胚中不規(guī)則、不透明的細(xì)胞。
形態(tài)差異的含義
鑒于這些形態(tài)差異，IVP胚胎真的更難分級(jí)嗎？1995年，F(xiàn)arin及其同事試圖通過一項(xiàng)研究來解決這個(gè)問題，其中六名經(jīng)驗(yàn)豐富的胚胎學(xué)家被要求對(duì)相同的IVP和IVD胚胎進(jìn)行分級(jí)。他們發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育階段，技術(shù)人員對(duì)IVD胚胎分級(jí)的一致性(85%)高于IVP胚胎的(72%)。區(qū)分IVP胚胎的桑葚胚和囊胚更具挑戰(zhàn)性。就質(zhì)量而言，IVD(61%)和IVP胚胎(58%)的一致性相似，其中最具挑戰(zhàn)性的是2級(jí)和3級(jí)IVP胚胎之間的分化。很可能是胚胎質(zhì)量不好，過多的碎片和擠壓細(xì)胞以及胚胎的不透明導(dǎo)致了評(píng)估者之間的差異。
結(jié)語
很明顯，IVP胚胎的形態(tài)與IVD胚胎不同。隨著IVP胚胎越來越多地融入到牛的繁殖實(shí)踐中，了解各種形態(tài)如何影響妊娠率，對(duì)于幫助從業(yè)者做出與IVD胚胎相當(dāng)（或更好）的妊娠率至關(guān)重要。我們現(xiàn)在有技術(shù)來生成必要的數(shù)據(jù)，為有關(guān)胚胎分級(jí)的問題提供近乎實(shí)時(shí)的反饋，為新手和有經(jīng)驗(yàn)的胚胎學(xué)家提供有價(jià)值的培訓(xùn)工具，以及信息數(shù)據(jù)庫，使我們能夠更好地了解IVP胚胎（包括具有上述形態(tài)的胚胎），并使IVP胚胎在全球范圍內(nèi)的行業(yè)中發(fā)揮更大作用
來源：
JenniferBarfield,Ph.D.Evaluation of in vitro-produced bovine embryos: Session:IVPvsIVD Embryo Evaluation[C].2441 Village Green Place Champaign,IL 61822 :American Embryo Transfer Association
編譯：可心
