此前在美國和加拿大胚胎移植協會的聯席會議上，有一個關于牛胚胎分級的會前研討會，與會者就如何對不同階段和質量的胚胎進行分級進行了探討，其中體外生產（IVP）和體內生產（IVD）胚胎之間的差異引發(fā)了大家更多關注。在這里，我們將回顧IVP和IVD胚胎分級所涉及的一些挑戰(zhàn)，并提出一種方法，以便于讓研究人員和從業(yè)者在此基礎上合作收集并輕松共享數據，為IVP胚胎分級提供最佳指南。
真正驗證胚胎質量的辦法是將其轉移給受體，看看是否有健康的后代產生。但移植每個胚胎是不切實際的，這就給從業(yè)者留下了一項艱巨的任務，即僅憑觀察就能確定胚胎是否能受孕。雖然大多數從業(yè)者依托國際胚胎移植協會（IETS手冊，第4版）制定的標準便可以更好地給體內產生的胚胎分級，并已經注意到IVP胚胎與IVD胚胎存在差異，如從線粒體功能和代謝到發(fā)育速率和基因表達的差異等。這里不再贅述。此次我們將專注于IVD和IVP胚胎之間的可觀察到的差異。因為大多數從業(yè)者和胚胎學家在看到一個好的胚胎時都知道是一個好的胚胎，但是當涉及到中等質量的胚胎（2級和3級）時，它們就很難區(qū)分了。許多人認為IVP胚胎具有更多可變的形態(tài)，因此更難分級。其實，可以根據胚胎是否符合一些物理特征進行分級，包括形狀，細胞質的顏色/密度，細胞的數量和致密性，卵周隙面積，擠壓或退化細胞的數量，細胞質囊泡的頻率和大小以及相對于年齡的發(fā)育階段等。以下是一些最顯著的差異。
·卵周隙和壓實性
幾項研究已經證明了IVP和IVD胚胎在卵周隙大小方面的差異，這通常與胚胎在桑葚胚形成過程中的壓實程度有關。在Van Soom和de Kruif(1992)的一項研究中，將IVD的受精卵和2細胞胚胎與屠宰場產生的IVP的受精卵在相同的系統中培養(yǎng)，可以觀察到體外受精胚胎桑葚胚期的卵周隙縮小了。此外，IVP受精卵時期的卵周隙在體外胚胎整個發(fā)育過程中是最大的。盡管自記錄以來已進行了24年的研究，這一特征目前在IVP胚胎中仍然可見(圖1)。
圖1 處于桑葚發(fā)育階段的IVP（A和C）和IVD（B和D）牛胚胎。注意IVP胚胎的卵黃周圍間隙較小，壓實性差。胚胎C的左上邊緣也有一些擠壓的物質。IVD胚胎的卵周隙較均勻，桑葚胚的壓實度也比較均勻。
碎片細胞和擠壓細胞
許多從業(yè)者和胚胎學家已經注意到與IVP胚胎相關的細胞碎片的數量和頻率有增加。這已在IVP和IVD胚胎的超微結構分析中得到證實。Rizos及其同事（2002）在胚胎的卵周隙中發(fā)現了細胞碎片，并在囊胚腔的內細胞團周圍發(fā)現了細胞碎片。這可能使IVP胚胎分級特別困難，特別是在囊胚階段，當碎片被壓縮在透明帶和擴張的胚胎之間，導致其數量可能難以評估。
國際胚胎移植協會胚胎分級指南規(guī)定，透明帶內可活胚胎的細胞質量超過85%為1級胚胎(最高質量)， 2級50%，3級25%，4級<25%。能夠有效地評估胚胎中活細胞的數量對于為胚胎分級是至關重要的。圖2和圖3提供了IVP和IVD胚胎在不同發(fā)育階段具有不同數量碎片的例子。
圖2 兩個IVP胚胎(A和B)和一個IVD胚胎(C)具有不同數量的擠壓細胞或碎片。A是一種桑葚胚，其細胞碎片數量最少，因此按照該標準可以被歸類為1級胚胎，但壓實性差和卵周隙極小將使該胚胎降至2級。B組是早期IVP囊胚，有大量碎片，可以將其歸入2級類別。圖C是第7天IVD胚胎，具有可接受的碎片量，因此它仍被視為1-或高級2+。
圖3 如果在相當低的功率下掃描這組胚胎，人們可能很快就會認為A圖中黃色箭頭所示的胚胎是1級胚胎。在高倍鏡下，人們可以更容易地看到擠壓在透明帶上的擠壓細胞，這可能被誤認為是內細胞團塊。這是一個很容易犯的錯誤，如果分級時沒有在適當的放大倍率下觀察胚胎(至少60倍)。無組織或內細胞團形成不良是IVP胚胎的另一個常見特征。圖C為內細胞團明確的IVP胚胎。
·液泡
一些胚胎的細胞中似乎有氣泡或液泡，這可能使它們呈現顆粒狀外觀。這發(fā)生在IVP和IVD胚胎中，盡管IVP胚胎的發(fā)生率似乎更高。IVP的胚胎在卵裂球的細胞質內表現出比IVD的胚胎更多的空泡化，液泡化的大小和豐度差異很大（圖4）。液泡化的原因尚不清楚，但通常與胚胎質量差有關。
圖4 兩個廣泛液泡化的IVP胚胎。左圖有一個6細胞胚胎有各種大小的液泡。右面有一個囊胚，在滋養(yǎng)層和內細胞團細胞中可以看到許多非常小的液泡。
·細胞形狀、不透明度和脂質
IVP和IVD胚胎的超微結構分析也揭示了與脂質含量有關的差異。并對來自超排卵奶牛的桑葚胚與來自屠宰場卵巢的桑葚胚進行了比較。IVP胚胎的脂質體積密度高于IVD胚胎。在整個培養(yǎng)過程中，10%血清培養(yǎng)的IVP胚胎在前72 h的脂質體積密度高于限制血清培養(yǎng)系統、無血清培養(yǎng)系統或體內產生的胚胎。其他研究小組也注意到IVP胚胎中脂滴的發(fā)生率高于IVD胚胎，證實了其他研究中注意到的情況，并與胚胎低溫耐受性差有關。較高的脂質含量可以使胚胎看起來更黑，細胞更不透明。和液泡一樣，胚胎也會呈顆粒狀。Van Soom和de Kruif(1992)指出，與IVD胚胎不同，IVP胚胎有更多方形、腫脹的卵裂球和囊胚中不規(guī)則、不透明的細胞。
形態(tài)差異的含義
鑒于這些形態(tài)差異，IVP胚胎真的更難分級嗎？1995年，Farin及其同事試圖通過一項研究來解決這個問題，其中六名經驗豐富的胚胎學家被要求對相同的IVP和IVD胚胎進行分級。他們發(fā)現，在胚胎發(fā)育階段，技術人員對IVD胚胎分級的一致性(85%)高于IVP胚胎的(72%)。區(qū)分IVP胚胎的桑葚胚和囊胚更具挑戰(zhàn)性。就質量而言，IVD(61%)和IVP胚胎(58%)的一致性相似，其中最具挑戰(zhàn)性的是2級和3級IVP胚胎之間的分化。很可能是胚胎質量不好，過多的碎片和擠壓細胞以及胚胎的不透明導致了評估者之間的差異。
結語
很明顯，IVP胚胎的形態(tài)與IVD胚胎不同。隨著IVP胚胎越來越多地融入到牛的繁殖實踐中，了解各種形態(tài)如何影響妊娠率，對于幫助從業(yè)者做出與IVD胚胎相當（或更好）的妊娠率至關重要。我們現在有技術來生成必要的數據，為有關胚胎分級的問題提供近乎實時的反饋，為新手和有經驗的胚胎學家提供有價值的培訓工具，以及信息數據庫，使我們能夠更好地了解IVP胚胎（包括具有上述形態(tài)的胚胎），并使IVP胚胎在全球范圍內的行業(yè)中發(fā)揮更大作用
來源：
JenniferBarfield,Ph.D.Evaluation of in vitro-produced bovine embryos: Session:IVPvsIVD Embryo Evaluation[C].2441 Village Green Place Champaign,IL 61822 :American Embryo Transfer Association
編譯：可心
